蒋多多| 疾病代谢标志物的快速检测 Science-王初课题组

蒋多多大家好，我这周分享的是science上的一篇文章：Semisynthetic sensor proteins enablemetabolic assays at the point of care。文章的通讯作者是来自马克斯普朗克医学研究所的Kai Johnsson教授，他目前的研究兴趣是操纵蛋白质功能的化学方法的开发和应用。
今天推荐的这篇文章则是报道了一种可以在护理点方便快捷地检测疾病代谢标志物浓度的方法。许多疾病都伴随着血液中特征性代谢物水平的改变，但是要做到POC（atthe point of care)的检测是比较困难的，作者试图通过建立基于测试纸的酶活反应来解决这个问题。他们选择的反应是NADPH的生成，这样就可以检测所有可以被NADP+氧化的代谢物。目前检测NADPH的反应大多具有背景高、干扰大的缺点，因此作者将目光锁定在了BRET（生物发光共振能力转移）上。他们设计的NADPH传感器包括受体蛋白，荧光素酶和带有荧光基团的配体这三部分结构，需要注意的是配体与受体之间的结合是NADPH依赖的，同时受体和配体之间是通过SNAP-tag结合的。当NADPH存在时，受体会与配体结合，拉近荧光基团与荧光素酶之间的距离从而产生BRET，然后通过荧光素和荧光基团的强度比可以知道NADPH的浓度。为了搭建这一生物传感系统，作者首先选择了eDHFR和TMP这一对NADPH的受体和配体，当在TMP中引入罗丹明荧光基团变成TMR时，eDHFR对其的亲和力在NADPH存在时增加了23倍（这个数字可以看做是该系统的灵敏度）。

为了提高该传感系统的灵敏度，作者认为可以让配体的结合部位先部分解折叠，然后加入NAPDH诱导其变回正确的构象，因此作者用cpDHFR代替eDHFR，该操作将灵敏度提高了150倍。而当作者在结合部位插入cpNLuc后，灵敏度提高了1400倍。最后作者设计的传感器里，用的是TMP的cy3类似物BG，在加入NADPH后，Nluc/Cy3的发射比值是15，C50（引起最大信号一半改变时NADPH的浓度）是5.1nM，同时对其他类似物NADP+,NADH和NAD+的选择性也很好。构建好系统后，作者的第一个应用是检测苯丙酮尿症中的苯丙氨酸含量。

作者将生物传感器在表面活性剂的存在下冻干到测试纸上，这样当血液中的红细胞接触测试纸时就会被裂解从而释放里面的苯丙氨酸。检测的步骤如下：取0.5微升指血；用反应液稀释50倍，反应液的成分是PDH（可以催化苯丙氨酸转化成苯丙酮）、NADP+、荧光素酶的底物；孵育10min后，取5微升加到测试纸上；最后用数码相机分析。该方法可以快速准确地测出病人血样中的苯丙氨酸含量，与MS-MS方法得到的结果相差较小。该方法所有操作不超过15min，仅需要0.5ul血样，方便便捷，也可被用于其他疾病中代谢标志物的检测，例如酪氨酸血症中的酪氨酸含量，缺血性中风的谷氨酸含量等等。
原文链接：
引用：DOI:10.1126/science.aat7992
作者：CY